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　　尽管大多数脑部疾病仍缺乏有效的治疗方法，传统小分子药物常因选择性差、易产生脱靶效应而带来副作用，而传统抗体虽具有高度特异性，却因难以穿越血脑屏障在脑部治疗中应用受限。纳米抗体是目前最小的免疫来源功能性蛋白，尽管一致认为纳米抗体难以进入大脑，但已有研究证实部分纳米抗体具备脑穿透能力，为治疗脑部疾病提供了全新思路。这些“微型抗体”或许正是打开大脑深处的关键。

　　在此，作者开发了一种二价双异位抗体，它由两种骆驼科动物重链抗体（称为纳米抗体）组成，一个与同二聚体代谢性谷氨酸受体2结合，另一个增强其活性。作者发现，这种二价纳米抗体通过外周给药后能够进入大脑，并在两个具有NMDA受体功能低下所致内表型的认知缺陷小鼠模型中显著改善了其认知障碍。有必要注意一下的是，单次腹腔注射后，这些体内效应可持续至少7天，且在亚慢性治疗后仍然维持其效果。作者的研究根据结果得出：纳米抗体可以靶向大脑受体，为基于纳米抗体的脑部疾病治疗策略奠定了基础。

　　为了在低浓度下也能在大脑中观察到药理作用，作者设计的思路是提高先前开发的mGlu2正向变构调节剂（PAM）纳米抗体DN13的亲和力。

　　使用两种不同的连接子将DN13与mGlu2选择性中性纳米抗体DN1或激动剂-PAM纳米抗体DN10融合，生成并筛选了一系列双价纳米抗体。这种策略用于提高纳米抗体与其靶点之间的结合力或停留时间。

　　作者最终选择了DN13–DN1，在激动剂存在的情况下，它对mGlu2的表观亲和力（Kd）比单独的DN13提高了十倍。此外，作者发现DN13–DN1增强mGlu2被激动剂LY379268和谷氨酸激活的能力比DN13强了近两个数量级。DN13–DN1的PAM效力也明显地增强。与DN13和DN111一样，DN13–DN1对mGlu2具有高度选择性。作者在脑组织中通过离体免疫组织荧光分析验证了DN13–DN1对mGlu2的特异性。在已知表达mGlu2的大脑区域，如前额叶皮层、海马、纹状体、小脑和嗅球均能检测到mGlu2信号。而在mGlu2缺失的小鼠脑组织中未检测到任何信号。

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　　为了评估腹腔注射这种给药方式是不是适合纳米抗体，首先分析了DN13–DN1和DN13在血液中的药代动力学特征。由于纳米抗体分子量较小，可能被肾脏快速清除。开发了一种基于时间分辨荧光共振能量转移（FRET）的检测的新方法用于定量分析腹腔注射纳米抗体后不同时间点采集的血液样本中纳米抗体的含量。结果显示，DN13–DN1的清除速度明显慢于体积更小的DN13且在血液中可检测到约8小时，部分注射的DN13–DN1成功穿透了大脑。在腹腔注射10 mg/kg剂量后，[3H]DN13–DN1在4小时达到脑组织中的最大浓度，总脑提取物中检测到约0.08%的放射性信号。放射性信号在注射后7天内仍可检测到。为了更直观地分析DN13–DN1在大脑中的分布情况，还进行了免疫组化分析。在小鼠腹腔注射DN13–DN124小时后固定脑组织并切片，使用可识别DN13–DN1中6×His标签的抗体进行标记。结果显示，在腹侧被盖区和皮层等多个脑区均可检测到DN13–DN1。而在对照组小鼠脑中未检测到免疫反应信号。这些根据结果得出DN13–DN1可以有明显效果地穿透大脑，激活mGlu2，在某些脑区富集，并且可在大脑中持续存在长达7天。

　　图二 DN13–DN1纳米抗体可改善神经发育期PCP诱导的精神分裂症小鼠模型中的识别记忆障碍

　　作者使用了一种新生期给予苯环己哌啶（PCP）的小鼠模型，该模型能够在成年动物中再现由NMDA受体功能低下引起的认知和其他行为改变，这些改变与精神分裂症的特征相似。在这个模型中，在出生后第7、9和11天给予NMDA受体拮抗剂PCP会引发成年期可检测到的认知缺陷，这种缺陷可通过新物体识别（NOR）实验做评估。通过脑室注射将DN13–DN1直接注入大脑（4 pmol/5 μl）能够恢复PCP处理小鼠在NOR任务中的正常认知表现。DN13–DN1的效果与LY379268相似。相比之下，以相同剂量注射mGlu2选择性中性纳米抗体DN1并未改善PCP处理小鼠在NOR任务中的辨别能力，这进一步证实了DN13–DN1作为PAM在行为效应中的关键作用。

　　此外，作者发现DN13–DN1、DN1或LY379268均未影响对照组小鼠在NOR任务中的认知表现。有必要注意一下的是，DN13–DN1仅在行为实验前24小时注射一次，即在NOR测试前48小时注射，而LY379268则在训练阶段和次日测试前各注射一次。综上所述，在行为实验前两天单次将DN13–DN1注入大脑可显著改善认知功能。当通过腹腔注射给药时，DN13–DN1同样恢复了PCP处理小鼠的认知能力，这与其能够穿透大脑的结果一致。事实上，PCP处理小鼠在NOR任务中的辨别能力，与给予LY379268或脑室注射DN13–DN1后的效果相似。重要的是，在注射DN13–DN1前30分钟给予LY341495完全抑制了DN13–DN1的作用。更重要的是，发现DN13–DN1在腹腔注射7天后仍能改善认知表现，而LY379268则不再起效。这表明，DN13–DN1能够调节大脑中mGlu2受体的活性，并在单次外周给药后维持长达7天的认知改善效果，而小分子药物不具备这一特性。

　　图三 DN13–DN1纳米抗体改善了GluN1-KD小鼠的工作记忆和感觉门控功能

　　为了在另一个NMDA受体功能低下模型中验证DN13–DN1的行为效应，作者使用了GluN1敲低（GluN1-KD）遗传性小鼠模型，该模型模拟了一种罕见的人类遗传性疾病GRIN1突变，GluN1-KD小鼠携带Grin1基因的低功能突变，导致全脑中含GluN1的NMDA受体数量减少，从而引起部分功能丧失。

　　GluN1-KD小鼠的行为特征与先前报道的低剂量NMDA受体拮抗剂处理的小鼠相似。这些小鼠在Y迷宫行为测试中表现出工作记忆受损。有必要注意一下的是，单次腹腔注射DN13–DN1（20 mg/kg）在注射后3小时显著改善了工作记忆。这一效果与LY379268（1 mg/kg）在测试前1小时注射的效果相似。作为对照，作者验证了在相同条件下，DN13–DN1和LY379268对野生型小鼠均无影响。更重要的是，在给药7天后，DN13–DN1仍然能够改善GluN1-KD小鼠的工作记忆，而LY379268处理的小鼠此时已不再表现出效果。这些根据结果得出，DN13–DN1能够在至少7天内持续改善GluN1-KD小鼠的短期工作记忆。这种长期效应源于该纳米抗体能够进入大脑并在其中持续存在达7天之久，从而增强mGlu2受体活性。

　　于是呢，作者通过声学惊跳反应的前脉冲抑制（PPI）测试评估其感觉运动门控功能。GluN1-KD小鼠的门控功能受损，当给予单次腹腔注射DN13–DN1后，这种门控缺陷在注射后3小时得到了改善。有必要注意一下的是，与作者在Y迷宫测试和PCP处理小鼠的NOR测试中观察到的结果相似，在不进行再次给药的情况下，7天后重新测试动物时发现，DN13–DN1仍然能够有效恢复GluN1-KD小鼠的PPI。事实上，7天后纳米抗体的效果甚至更强。野生型和对照处理的小鼠在两次测试中表现相似，表明小鼠并未因前一次实验而产生习惯性反应。此外，在首次测试当天，DN13–DN1的效果与LY379268在测试前1小时注射的效果相当；但7天后，在未再次给予LY379268的情况下，只有接受DN13–DN1治疗的小鼠仍表现出改善。DN13–DN1治疗并未改变mGlu2受体在不同脑区的表达水平，且所观察到的行为效应与动物的性别或体重无关。综上所述，DN13–DN1在单次腹腔注射后，能够长期改善GluN1-KD小鼠的认知缺陷和感觉运动门控障碍，而小分子药物的作用则更为短暂。

　　图四 亚慢性DN13–DN1治疗可恢复两种精神分裂症小鼠模型中的行为缺陷

　　在证实了腹腔注射mGlu2纳米抗体可在两种小鼠模型中改善由NMDA受体功能低下引起的缺陷之后，作者进一步研究了这种改善效果是否能在亚慢性给药方案下维持。

　　于是采用了一个亚慢性给药方案：初始剂量为10 mg/kg腹腔注射，随后每隔一周给予三次剂量，每次1 mg/kg，在神经发育期PCP模型和遗传性GluN1-KD模型中均进行该处理。在该方案下，亚慢性给予DN13–DN1显著改善了识别记忆、工作记忆和感觉门控功能，这些改善效果不依赖于动物的性别或体重。此外，亚慢性给药还降低了GluN1-KD小鼠的过度活动。有必要注意一下的是，亚慢性给予DN13–DN1并未改变在两个动物模型中所检测的大脑中mGlu2的表达水平。这表明，纳米抗体治疗不会引起受体表达的下调，因此适合重复给药。此外，未发现DN13–DN1亚慢性给药引起任何毒性反应，野生型小鼠的活动能力也未受一定的影响。综上所述，这些根据结果得出DN13–DN1可能是一个具有潜力的候选药物。

　　综上所述，作者的研究为开发基于纳米抗体的免疫疗法、通过低频次、外周给药方式治疗脑部疾病开辟了新的途径。此外，DN13–DN1将有利于理解由NMDA受体功能低下引起的各种认知障碍，例如精神分裂症或是与罕见人类遗传性GRIN疾病相关的认知缺陷，并进一步明确mGlu2受体激活在病人治疗中的实际意义。

　　需要注意的是，尽管纳米抗体作为潜在治疗工具展现出良好前景，但仍需进一步研究以最大限度地减少可能的副作用。此外，不能完全排除DN13-DN1可能会产生的外周效应，因为mGlu2受体在肺等非神经组织中也有表达。然而，由于纳米抗体在外周的半衰期较短，这类副作用可能具有时间限制性。未来仍需进一步明确纳米抗体的最佳治疗形式及其给药途径以推动其在临床中的应用。